文/纵观人间事

编辑/纵观人间事

前言

泰国斗鱼隶属于硬骨鱼类门鲈形目、攀鲈亚目、丝足鲈科、斗鱼亚科，因其颜色鲜艳、形态多样、易于饲养等特点而成为众多观赏性鱼类中的宠儿。

泰国斗鱼在性别上存在着明显的性别分化，雄鱼具有天然的侵略性和廉价的经济优势，是研究鱼类侵略性的理想试验动物。

进攻性是一个由多个遗传因子共同作用的性状。

研究表明，5-HT通路、多巴胺通路、组胺通路、下丘脑-垂体-肾脏轴、下丘脑-神经-垂体系统、下丘脑-垂体-性腺系统、一氧化氮通路、生长激素statin通路等都参与了该过程。

5-羟色胺又称血清素，由吲哚和乙胺组成，是一种单胺类神经递质，在动物体的情绪调节、体温调节、新陈代谢调节中起重要作用，是5-羟色胺通路中的重要物质之一，其转运体和受体是许多神经类药物的作用靶点。

已有研究表明，5-羟色胺与鱼类攻击性调节有着非常紧密的联系，其参与的信号传导途径中的色氨酸羟化酶（Ttph）在交配竞争后，在交配群体中的分布会发生改变。

而5-羟色胺则会在交配竞争中被显著地上调，从而改变了交配群体的分布格局。

然而，目前对其侵略性的分子调节机理还知之甚少，亟需深入研究。

因此，本项目拟采用RT-PCR技术，首先从泰国斗鱼大脑中克隆并鉴定出优秀氨酸羟化酶基因的cDNA片段，其次采用配对对抗和镜像对抗两种方式，观测并纪录泰国公斗鱼的搏杀过程。

随后再采用荧光定量PCR技术，对比对抗过程中各个体之间以及优势与弱势个体之间tphmRNA的表达量变化，从而揭示tph在泰国斗鱼攻击性中的作用机理。

tph中间片段的克隆及特异性引物的设计

实验用鱼为泰国公斗，体长5-8厘米，可在网店里买到；仪器设备为台式冰冻离心装置、荧光实时定量PCR装置。

通过美国全国生物科技资讯中心，查找与泰国斗鱼相近的鱼的tphcDNA基因。

本项目拟以尼罗罗非鱼、军曹鱼和尖齿胡鲤为研究对象，采用ClustalX软件比较其与其它几种不同类型的tph蛋白家族成员。

通过比较其家族成员之间的差异，设计出相应的简化引物，并结合已有的数据，对泰国斗鱼的tph基因家族成员进行初步的功能验证（表1）。

随后应用Trizol技术进行了大鼠的全RNA的提取，用消毒过的剪刀和镊子将泰国斗鱼脑片取出，置于1.5ml的离心机中，加入1ml的LTrizol液体，用一次性针筒搅拌，使其达到均一。

将其置于室温5分钟后，添加0.2毫升三氯甲烷，振荡30秒；在室温条件下，5分钟，4℃，12000r.m-1，离心15分钟；取400ml的上清液于新的1.5ml的离心器中，加0.4ml的异丙醇，将该离心器轻轻翻转几次，然后在室温静置10分钟；4℃，12000r.m-1，离心10分钟后，在其底部发现了一些RNA的白色沉淀物。

将上清液仔细倒出，再加1mL75%酒精，将沉淀物冲洗干净，重复冲洗两遍；去除上清液，开启瓶盖，使其在室温下自然干燥。

然后再添加10-20微升的脱核糖核酸酶水，使其溶解核糖核酸沉淀；以0.8%的琼脂凝胶电泳法测定RNA的含量，并将其置于-70℃的冷冻环境中进行冷冻保存。

由于mRNA3'端有poly（A）尾，因此以OligdT为引物，通过反转录酶将mRNA反转录到cDNA上。

在得到cDNA之后，使用内参考基因beta-actin引物对其进行PCR，然后对PCR产品进行分析。

如果PCR产品条带是单色的，并且是清楚的，那么就说明该产品的品质是合格的，可以作为后续试验的依据。

采用高品质cDNA作为模板，使用表1所示的简并引物对tphcDNA片段进行了扩增。

然后，根据预测的长度，对其进行测序，获得tph基因的某些碱基序列；采用PrimerPrimer5.0开发了特异性的引物，并进行了PCR检测。

配偶竞争方法是将两种雄性鱼种放在相同的环境中，通过对它们的竞争行为进行观测和记录，根据竞争的最终结果，将它们划分为优势（D）和弱势（I）。

镜象搏斗是指将一块镜子放置在一个大约22.5度的角度下，用它来观测和记录雄性和它的镜象之间的“打斗”。

试验的具体方案是选择13条大小与规格相近的泰国公斗鱼，将它们设定为未经斗争的实验组（B）、配对斗争的实验群（F）、镜像斗争的实验群组（M)。

这两条均为后斗争群落（A)，每个未经斗争的实验群落（B）需要1条雄的，每个配对斗争群落需要2条公的，每个镜像对抗群落（M）需要一条公的。

每个对照组需要重复3个周期。

为了对定量进行修正，还需要一条未经任何治疗的雄体B0，因此总共需要13条雄体泰国雄体B0（表2）。

纠正后的泰国斗鱼与非抗争模型对照组均不作其他处理，而是取其大脑，抽取其全部RNA。

在进行配对斗争的实验组中，优势个体被记录为D，弱势个体被记录为I，一共展开了3次实验，最终得到了3个实验组D1、I1,D2、I2,D3、I3。

在每一实验组斗争结束之后，都需要快速收集斗鱼的全脑，并提取总RNA。

首先，以修正组B0的cDNA产物为模板，利用特异性引物对进行荧光定量PCR，通过相对定量方法获得不同组分tph的表达水平。

在此基础上，我们使用2-*△Ct方法来处理这些数据，并使用对照样、待检样中的内标基因和目标基因的循环阈值，将内标基因的Ct值作为内源性控制来修正目标基因，从而得到待测样的相对表达量。

将两组间的QR值分别导入SPSS17.0中，通过多因素比较和多因素比较。

泰国斗鱼tph的cDNA克隆

随后使用0.8%琼脂糖凝胶电泳，对各样本总RNA的质量进行检测，将具有良好品质的总RNA作为模板，展开下一步反转录实验，获得cDNA。

以cDNA为模板、β-actin为引物，展开PCR扩增，之后用1.5%琼脂糖凝胶电泳，对PCR产物进行扩增，如果每份cDNA都扩出单一、清晰的β-actin条带，则说明cDNA的质量是良好的（图1）。

利用tph-F、tph-R两个简化引物，将修正组B0的cDNA作为模板，对tph的cDNA进行扩增，再用1.5%的琼脂凝胶电泳对PCR产物进行测定。

结果显示，281bp附近存在所需的条带（图2）。

利用NCNI的NucleotideBLAST软件对上述基因进行了同源分析，结果表明：该基因与军曹鱼、黄鳝、大黄鱼、黄金鲈、高体鰤、半滑舌鳎、大刺鳅、黄条鰤、尖吻鲈、南极鳕、印度玻璃鱼、牙鲆、深裂眶锯雀鲷中的tph基因具有94%的同源性。

结果表明，所获得的cDNA片段属于泰国斗鱼tph基因的一部分。

泰国斗鱼tph的序列分析

将测序所得的核酸序列，输入到DNAStar7.1软件Editseq程序中，人工搜索打开读取框ORF，可以获得84个氨基酸序列，其结果是：
KGELRAYGAGLLSSISELKHALSGNARIMPFDPKVTSKQECIITTFQDVYFVSDSFEEAKVKMREFAKTIKRPFTVRYNPYTQR。

通过对其它一些已知的鱼类tph蛋白的比较，发现泰国斗鱼的tph蛋白与军曹鱼、黄鳝、大黄鱼、黄金鲈、高体鰤、半滑舌鳎、黄条鰤、尖吻鲈等物种的tph蛋白相似度达到97.59%；与刺鳅，牙鲆，深裂眼齿鱼等物种的tph蛋白相似度达到96.39%，显示出较高的物种一致性。

利用NCBI数据库检索其它种类和泌乳纲、爬行纲的几个代表种的tph核酸，并与泰国斗鱼的tph核酸进行比较。

之后再利用MEGA7软件将其转化为可被MEGA7鉴定的形式，并利用邻近比邻法构建进化关系（见图3）。

泰国斗鱼与军曹鱼、大黄鱼等均为鲈形目，在演化树中为一个大分支，与鲑形目中的虹鳟鱼、鲤类斑马鱼之间的基因间隔较为遥远，而与海洋七鳃鳗、小白鼠、兔子、智人和非洲爪蛙之间的基因间隔则呈递增趋势。

将两条雄性鱼类同时放在一个透明的烧杯中，双方立刻开始了一场战争。

A会突然做出一个摇晃动作，让迎面而来的B会改变自己的方向，或者是A会突然袭击附近的B，让它逃脱并回到原来的位置。

然后它们就会绕圈，然后就会尝试去咬彼此。

当将镜子放入有一尾雄性斗鱼的透明烧杯中后，斗鱼立刻展现出好斗性行为：腮张开，鳍条直立和身体颤动及起伏等，好斗性强的个体更表现在用尾巴碰撞镜像、张嘴撕咬镜像等斗争行为。

通过对不同个体间tph基因mRNA在抗争前后和抗争后的变化，分析其在抗争前后和抗争后的变化。

试验共分成5组：校对组（B0)，斗争之前组（B)，配对斗争组（M)，其中B组、D组、I组、M组各由3个并行组成。

将测序结果输入到PrimerPrimer5.0软件中，设计出各项得分最高的特异性引物：qtph-F、qtph-R，此引物的溶解曲线呈现为单峰，这证明PCR产物专一，引物选择性强，可以应用于定量表达分析。

将校对组B0作为控制样本，将它的tphmRNA表达值设置为1，对剩余样本的相对表达值QR进行方差分析，结果显示在表3中。

方差分析显示，D组、I组和M组与B组比较有统计学意义（P<0.05)；其中，D组和I组与B组比较有显著性意义（P<0.01)（表3）。

上述研究结果显示，不论成对或成群的抗争，其tphmRNA在抗争后的表达量均显著增加；配对斗争中，优势个体D的表达量极显著高于劣势个体I，也极显著高于镜像斗争后个体M。

讨论和结论

本文采用RT-PCR方法，从泰国斗鱼体内获得了一个253个碱基片段，对泰国斗鱼tph基因进行了BLAST同源分析，发现其与其它种类的tph基因具有90%的同源性，由此推测该基因可能是泰国斗鱼tph基因的一部分。

通过BLAST的氨基酸序列比较，发现泰国斗鱼tph与军曹鱼、黄鳝、大黄鱼、黄金鲈、高体鰤均有超过96%的相似度，说明其与其它种类的tph基因存在较高的相似性。

通过对泰国斗鱼的分子演化图谱分析，发现其与其他物种之间的基因演化密切相关，而与三文鱼和鲤鱼的基因演化密切相关。

已有报道显示，雄鱼经配对搏斗后，优势种的5-HT系统在末端脑区呈活化状态，而弱势种的5-HT系统则呈活化状态。

通过群体交互作用，我们发现在雌雄斑马鱼中，tph在其优势种群的下丘脑中显著高表达。

与以上侵略性的实验结果类似，不论采用配偶抗争或镜像抗争，泰国斗鱼在抗争后其体内都显著大于非抗争者。

在对战状态下，优势种D的表达量明显大于弱势种I，且在经过对战状态后，也明显大于镜像状态下的M，说明在泰国斗鱼种群处于对战状态时，其tph基因的表达力明显升高。

由此说明tph与雄性泰国斗鱼的好斗性呈明显的正相关，说明色氨酸羟化酶基因tph表达确实参与了泰国斗鱼好斗性的调控，但具体的分子调控机制还有待进一步深入研究。

参考文献：

［1］陈思行，李励年《暹罗斗鱼的饲养与繁殖》

［2］王桂香《骁勇善战的斗鱼》

［3］王婷《拼命将军“泰国斗鱼”》