PAMPs和TDCIPP共同作用导致斑马鱼肝脏结构受损，甚至可能致命

09-19

PAMPs和TDCIPP联合暴露使斑马鱼肝脏结构损伤明显加重，细胞排列疏松、间隙增大、索状结构消失，细胞间质增加，出现大规模的核萎缩、溶解和胞质溶解现象，组织坏死形成空洞。

上述观察结果与肝体指数下降、氧化损伤和炎症因子水平结果是一致的。

GC-MS/MS分析共检测到60种肝脏代谢物，主要包括糖类、脂肪酸、氨基酸、脂类、小分子酸和胆固醇等。

PCA结果显示，空白组(Control)、PA、0.4μg·L-1 TDCIPP(T0.4)、2μg·L-1 TDCIPP(T2)和0.4μg·L-1 TDCIPP+PA(PA-T0.4)处理组呈现聚集趋势，而10μg·L-1 TDCIPP(T10)、2μg·L-1 TDCIPP+PA(PA-T2)和10μg·L-1 TDCIPP+PA(PA-T10)这3个处理组之间相关性较高，表明PA和低、中浓度TDCIPP单一暴露组斑马鱼肝脏代谢产物成分和含量与空白对照相似，而高浓度TDCIPP及中、高浓度复合暴露组中代谢物成分和含量与空白存在明显差异，表明PA共存显著增强TDCIPP对斑马鱼肝脏内源代谢过程的干扰作用。

代谢物 Metabolites	空白对照 Control	PA	T0.4	T2	T10	PA-T0.4	PA-T2	PA-T10
9，12-十八碳二烯酸9，12-octadecadienoicacid	88703051	166174261	117952040	148747956	156411202	169352468	270283296	552565263
二十二碳六烯酸 Docosahexaenoicacid	357151002	678925343	283011169	297604156	268932644	309980112	628425446	1136430373
二十碳五烯酸 Eicosapentaenoicacid	271640960	503566417	280390966	263868256.4	272103910	516269493	553604701.1	740589052
亚麻酸 Linolenicacid	88554679	150772110	99353784	181922221	181990221	197822012	325093529	599174706
十八碳烯酸 Octadecenoicacid	119596900	93053265	155674072	147260082	214456722	234551098	310353784	442260082
亚油酸 Linoleicacid	191469614	306390815	222041051	260593961	309668649	310468429	386804028	680394009
肉豆蔻酸 Myristicacid	135116292	111972140	121545996	164001008	118572223	130996972	340940646	236419273
棕榈酸 Palmiticacid	192434646	150283679	196749596	147456605	167034327	167971307	610462753	706175086
花生四烯酸 Arachidonicacid	549812784	888597205	668971121	685654935	598041681	669595904	1238563282	6276436744
十六碳烯酸 Hexadecenoicacid	32476093	49546749	34285264	25136122	39307804	99656822	115609988	148922221
尸胺 Cadaverine	2324788931	2317194611	2290887111	898001111	167526762	1600981121	613011169	260295323
L-半胱氨酸 L-cysteine	538015125	559022111	538900111	221244588	174349389	453389000	250390966	181352969
甘氨酸 Glycine	605478478	749337614	717081168	547456605	526286447	593995840	233796923	218310513
异亮氨酸 Isoleucine	363613203	313884357	286804028	247309785	129129032	309603103	241661228	123072982
氧化脯氨酸 5-oxoproline	743763083	586044522	619097366	541255290	504707331	534244054	85146458	82789965
L-丙氨酸 L-alanine	164231861	101894525	128425446	125776121	126558862	100031746	152011056	68308639
精氨酸 Arginine	447625294	441815925	409800121	378925647	325187222	351759672	164897095	53610051
谷氨酸 Glutamate	327297628	301262243	283604701	212601003	209685057	275989518	85077907	25683825
L-谷氨酰胺 L-glutamine	260295323	259115112	209855631	142504268	108315198	172534979	117081167	66419273
L-亮氨酸 L-leucine	234728381	177421907	157783211	159332913	126837432	129003211	230090578	191469614
L-赖氨酸 L-lysine	468992631	494088868	640940646	510419507	218624335	282598613	364032725	201741851
L-蛋氨酸 L-methionine	90535402.1	96317120	104622753	141546653	35645843	91770999	88537877	80394010
L-正亮氨酸 L-norleucine	230923757	252396708	228001311	105405772	20891114	189900321	136286048	84034138
L-鸟氨酸 L-ornithine	340692298	379642533	308563282	290592347	269157758	301986153	203001465	151745086
L-苯丙氨酸 L-phenylalanine	155419685	194555846	156309988	187937562	141249855	108744321	99097366	51916691
L-脯氨酸 L-proline	164669240	145395535	132582289	113326016	111760141	109696241	97283296	76087975
L-苏氨酸 L-threonine	254141918	307781706	258586238	145760775	120372687	220509423	208425446	58853490
L-酪氨酸 L-tyrosine	255749806	281352969	288759978	141045156	156114913	284726332	183604701	108758249
L-缬氨酸 L-valine	239439570	218310513	203110849	264895445	148023434	200466105	162550909	73849084
腐胺 Putrescine	310888022	301741851	307741298	325237566	242331906	230324806	170375072	129582680
丝氨酸 Serine	554275106	558758249	517216662	59209590	438391581	464553992	448720588	144225313
延胡索酸 Fumaricacid	212018109	120747956	227371348	182164139	133771421	156452241	72476093	43218837
阿拉伯糖 Arabinose	117314790	170166455	116199368	108992111	98990211	108945111	89596900	75589669
纤维二糖 Cellobiose	2153271436	1620467862	1610952168	1476901211	380863709	1469312246	1143045989	234728381
吡喃葡萄糖 Glucopyranose	119835809	123676967	106363588	124188400	47631760	98003211	28703051	10092631
酮戊二酸 2-oxoglutarate	1704539393	1689001111	1404371167	1392616713	1006609690	878336335	549812784	90535402
吡喃甘露糖 Mannopyranose	221809617	176087975	165553341	136670911	100656791	151003638	91516676	20923757
甘露糖 Mannose	246671903	191096286	195013207	178055469	88041082	187881642	65953422	55419685
果糖 Fructose	1873370159	1775424857	1700921111	1679002111	1110891132	1563200111	604040428	164669240
半乳糖二酸 Galactaricacid	172426388	169002111	133796923	120990134	102651324	133454592	82194066	54141918
半乳糖醇 Galactitol	76390436	54925393	51661228	48932111	42442515	48900213	33271436	25574980
呋喃半乳糖 Galactofuranose	272220202	202497730	198001561	174463545	108933211	173652101	111773722	89439570
半乳糖 Galactose	700901121	675261022	585146458	437464641	236877676	572255055	117314790	69631951
山梨醇 Sorbitol	262955641	296916426	220981132	209912111	138524579	249013211	66463225	33572159
葡萄糖酸 Gluconicacid	396305854	317554202	452011056	317951518	133090011	318836978	112220202	15116292
葡萄糖 Glucose	5705869478	3053335082	5988540874	2365518083	2538583507	5405421162	2262955641	310888022
乳糖 Lactose	547069011	482789965	521155748	436122730	328363235	487900122	91318527	54086643
甲基半乳糖苷 Methylgalactoside	106792657	198308639	116497893	77987885	65091222	113437021	55869478	22729186
丙酮酸 Pyruvate	127196038	80011113	121704534	125386416	98383234	99990242	19797788	12434646
琥珀酸 Succinicacid	1071916691	490021111	988001255	401035678	590446553	695036060	547069011	239386666
异柠檬酸 Isocitrate	217291628	129582680	211291535	205599589	108288735	178998385	68342701	11313991
棕榈酸单甘油酯 1-monopalmitin	293828013	278153852	256554778	286389428	461623372	214525771	816363588	902442515
氨基丁酸 4-aminobutanoicacid	117448945	127604156	108066417	127053994	135237050	171350501	406609690	602497730
乙酸 Aceticacid	386887814	375026519	280734234	245508195	531750734	452521350	358583507	508524579
胆固醇 Cholesterol	169534221	150469810	226491786	281955011	441158284	252789062	674349390	673286230
肌酸酐 Creatinine	604040428	571654625	710558637	593130101	917919962	1056946498	978041082	1054367093
甘油 Glycerol	400710855	316041108	414897095	420593961	973286230	373922639	2178925343	3726286447
单硬脂酸甘油酯 Glycerolmonostearate	91537500	90000419	85077907	164001008	164367093	84589263	224671903	369164192
乳酸 Lacticacid	143722382	226255592	120283296	123695554	83541301	241008951	202103910	220692003
尿素 Urea	280554917	271353871	263205118	220019258	204790321	298000211	202651324	140737788

以差异倍数(处理组/对照组)≥1.5或≤0.66为标准筛选显著差异的代谢物，并导入MetaboAnalyst5.0进行代谢路径富集分析，结果显示，单一PA暴露显著抑制三羧酸循环(TCAcycle)过程、丙酮酸代谢(pyruvatemetabolism)、糖酵解与糖代谢(
glycolysis/gluconeogenesis)以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine，
aspartateandglutamatemetabolism)。

单一的TDCIPP暴露显著抑制肝脏半乳糖代谢(galactosemetabolism)、TCA循环以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，这些结果表明PA或TDCIPP胁迫主要抑制斑马鱼肝脏能量的合成，同时影响糖代谢中间产物氨基酸的合成过程。

然而，在PAMPs和TDCIPP复合处理组中，斑马鱼肝脏TCA循环、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸代谢(argininebiosynthesis)、谷胱甘肽代谢(glutathionemetabolism)和D-谷氨酰胺D-谷氨酸代谢(
D-glutamineandD-glutamatemetabolism)等过程均显著下调，与此同时，不饱和脂肪酸代谢(
biosynthesisofunsaturatedfattyacids)路径明显上调，相比于单独的PAMPs或TDCIPP，二者复合暴露对与抗氧化物质(如GSH、氨基酸)生物合成和炎症反应相关的不饱和脂肪酸等的代谢干扰显著加剧。

MPs和TDCIPP是水环境中普遍存在且备受关注的新污染物，二者不可避免地共存于水体环境，目前关于TDCIPP和MPs单一毒性效应的研究较多，而二者联合生物效应的毒理学数据十分缺乏，尤其是环境浓度条件下的相关研究亟待开展。

本研究将PA(100μg·L-1)、不同浓度TDCIPP(0.4、2和10μg·L-1)及其二者复合后暴露于成年斑马鱼，通过系统比较不同处理组斑马鱼肝脏发育、氧化应激、炎症因子、TDCIPP富集量及内源代谢物的变化，探究环境相关浓度MPs对TDCIPP诱发斑马鱼肝脏毒性效应的影响及其分子机制。

研究结果表明，100μg·L-1 PA和低浓度(0.4μg·L-1和2μg·L-1)TDCIPP暴露未对斑马鱼体长、体质量和肝体指数产生明显影响，10μg·L-1 TDCIPP会导致斑马鱼体质量降低，同时PA共暴露显著增强TDCIPP对斑马鱼体长、体质量和肝脏生长的抑制作用。

前期研究证实，PAMPs可吸附水体中的TDCIPP(饱和吸附容量为0.363mg·g-1)，作为载体增强TDCIPP在斑马鱼肠道内的富集；因吸附态TDCIPP在肠道流体内可以快速解吸，PA显著促进了TDCIPP向鱼体生殖器官的迁移。

本研究对肝脏内TDCIPP定量分析发现，相对于单一TDCIPP暴露，PA共存导致斑马鱼肝脏TDCIPP富集量增加了1.3倍～1.7倍，再次证实PAMPs在TDCIPP生物转运过程中的载体作用。

Zhao等研究发现纳米PS可促进TDCIPP在斑马鱼成鱼体内的富集并向子代迁移。

因此，PAMPs促进TDCIPP的肝脏富集量是联合暴露诱发明显斑马鱼肝脏损伤的原因。

然而，相反的报道指出，PAMPs吸附双酚A、壬基酚和菲后，复合体的团聚和沉降行为降低水相中有机物的浓度，进而缓和了有机物对大型蚤(Daphniamagna)[10]、小球藻(Chlorellapyrenoidosa)和淡水甲壳类动物(Gammarusroeseli)的毒性效应。

MPs从水体转运到以上受试生物体内的方式有差异，本研究中PAMPs增强TDCIPP对斑马鱼的肝脏毒性，与斑马鱼易于摄食负载TDCIPP的MPs颗粒物导致靶器官内TDCIPP含量高有关。

鉴于MPs与共存有机物的复合生物效应是微塑料-有机物-生物体三元体系中不同相互作用过程的结果，我们进一步探讨了MPs影响TDCIPP肝脏毒性作用的相关机制。

肝脏作为生物新陈代谢、异物解毒和有害物质排泄的主要器官，是众多有毒有害化合物的毒性作用靶器官，而活性氧、抗氧化物和炎症因子是肝脏损伤的敏感生物标记物。

本实验研究发现，100μg·L-1 PA和10μg·L-1 TDCIPP单独暴露导致斑马鱼肝脏ROS水平、SOD及GPx活性升高，但是MDA含量无显著变化，表明PA和TDCIPP单独暴露均诱发氧化应激但是并没有形成明显的氧化损伤，而PA和TDCIPP联合暴露导致斑马鱼肝脏出现显著的氧化应激和氧化损伤，主要表现为肝脏ROS水平和脂质过氧化物MDA的含量明显增高。

研究表明，MPs的毒性靶器官与其粒径密切相关。

例如，100μg·L-1的PSMPs(粒径≦1μm)暴露使斑马鱼肝脏和性腺组织内ROS水平升高，扰乱鱼类的抗氧化防御系统，诱发明显的氧化损伤。

然而，粒径>5μm的MPs则很难穿透肠道上皮细胞进入鱼的内脏器官，粒径为5μm的PS可以在斑马鱼鳃、肝脏和肠道中积累，20μm的PS仅在鱼鳃和肠道中积累。

本研究中，PA粒径为1~20μm，平均粒径为(15.2±7.4)μm，大部分塑料颗粒无法转运进入肝脏细胞，这可能是同样浓度PAMPs暴露没有诱导斑马鱼肝脏出现明显氧化损伤的原因。

因此，二者联合暴露诱发斑马鱼出现更为严重的肝脏氧化损伤，这可能主要由PA促进TDCIPP肝脏富集导致的。

单一TDCIPP暴露组未观察到明显炎症反应，单一PA处理组中肝脏炎症因子IL-6的含量显著升高，然而100μg·L-1 PA和10μg·L-1 TDCIPP复合组中TNF-α和IL-6含量相比空白组分别提高50.3%和94.3%(P<0.05)，表明PA显著加强了TDCIPP对斑马鱼肝脏免疫系统的影响。

氧化应激和炎症反应会引起肝脏出现病理学损伤，最终导致肝排泄和解毒功能异常。

实验研究发现，10μg·L-1的TDCIPP处理对鱼体肝脏组织结构无明显影响，单一PA处理后斑马鱼肝细胞基质变淡，出现轻微的细胞核萎缩变形、核溶解和组织坏死情况。

二者复合暴露后，肝脏结构损伤明显加重，细胞排列疏松，间隙增大，大量的细胞核萎缩、溶解，组织坏死、空洞现象出现。

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